食品和动物饲料中四种霉菌毒素的精准检测技术开发及应用
    来源:http://www.zjkjt.gov.cn时间:2017-07-14

    科技成果登记表
     
    成果名称  食品和动物饲料中四种霉菌毒素的精准检测技术开发及应用
    成果登记号  17026011 知识产权  专利
    完成单位
    序号 单位名称 通讯地址
     1  浙江农林大学  浙江省临安市环城北路88号
    完成人
    序号 姓名 工作单位 对成果的贡献
     1  程昌勇  浙江农林大学  项目组织实施及适体筛选
     2  宋厚辉  浙江农林大学  毒素检测技术的应用和推广
     3  邵春艳  浙江农林大学  基于量子点技术的毒素检测方法建立
     4  杨杨  浙江农林大学  毒素偶联及单克隆抗体制备
     5  王晓杜  浙江农林大学  检测试剂盒测试、标准化及推广
     6  孙静  浙江农林大学  基于单克隆抗体技术的毒素检测方法建立
     7  章先  浙江农林大学  毒素特异性适体库的筛选及检测方法建立
    成果公报内容(成果简介、创新突破点、同行认可、引用情况、应用情况等)
            本成果利用单克隆抗体技术、量子点技术、核酸适体技术、免疫胶体金技术构建了食品和动物饲料中主要霉菌毒素(赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素和玉米赤酶烯酮)的精准检测技术体系和平台,为食品安全保驾护航。主要结果如下: 1.抗赭曲霉素A、黄曲霉毒素AFB1、伏马毒素FB1和玉米赤酶烯酮ZEN的特异性单克隆抗体制备及针对该些毒素的ELISA检测方法建立:将毒素分子与载体蛋白偶联,按照常规方法获得杂交瘤细胞,ELISA筛选和克隆化,获得高效价的特异性单抗用于后续研究。研究结果:项目筛选得到4种真菌毒素单克隆抗体,为黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮ZEN、伏马毒素FB1,并基于该些抗体建立了针对毒素的ELISA检测方法,具有很好的特异性及敏感性。具体详见技术报告。 2.量子点"人工抗体"制备:采用最新的量子点制备技术研制具有高发光性能的多色量子点,利用先进的表面分子印迹技术在多色量子点表面合成对生物毒素具有高选择识别富集性能的壳-核型、具有荧光的"人工抗体"。研究结果:项目建立了基于量子点阳离子交换信号放大系统的赭曲霉毒素A检测方法线性区间为0.03-0.93 ppb,检测下限约为0.02 ppb,检测时间约45 min,与常规的间接ELISA检测方法相比,检测时间缩短,灵敏度提高,为后续荧光免疫检测方法的建立与应用奠定了基础。 3.毒素特异性核酸适体制备:合成N=40-45的随机序列双链dsDNA文库,然后利用不对称PCR构建单链DNA文库。应用SELEX技术筛选能够与目标毒素分子具有高度结合力的候选适体,并对其进行克隆和测序。人工合成获得特异性适体,并构建适体芯片进行毒素检测,并将毒素分子偶联到纳米颗粒上,利用免疫学、化学发光或荧光成像技术进行信号放大。研究结果:项目利用适体识别并结合毒素、荧光染料PicoGreen识别双链DNA的原理,建立了一种基于适体与PicoGreen检测毒素OTA和FB1的方法。最优反应体系为:10 mmol/L Tris,120 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH 8.5)。荧光检测参数为:激发波长为480 nM,发射波长为520 nM。灵敏度分别为1 ppb和0.1 ppb,检测范围1 ppb~200 ppb。特异性实验表明:适体-PicoGreen方法检测OTA和FB1的特异性强,与黄曲霉毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。在检测敏感性和特异性方面与传统的基于抗体的ELISA方法相当。 4.综合应用上述高新技术体系,结合免疫吸附、层析、荧光或化学发光成像、传感器和芯片等技术,实现食品和动物饲料中赭曲霉素A、黄曲霉毒素AFB1、伏马毒素FB1和玉米赤酶烯酮ZEN的快速、精准、灵敏检测技术体系,开发成检测试剂盒和胶体金试纸条并加以应用推广。
    评价(鉴定、验收)委员会名单
    序号 姓名 单位 专业领域 职称
     1  李肖梁  浙江大学  预防兽医学  正高
     2  张晓峰  浙江省出入境检验检疫局技术中心  预防兽医学  正高
     3  李龙  杭州贝尔塔生物技术有限公司  预防兽医学  正高
     4  王德前  浙江省农业科学院  食品质量与安全  副高
     5  周惠清  杭州钱王会计师事务所有限公司  审计学  副高
    组织评价单位:  浙江省科技厅      评价形式: : 验收
    评价(鉴定、验收)意见
             2017年3月26日,受浙江省科技厅委托,浙江农林大学组织专家对公益技术研究农业项目"食品和动物饲料中四种霉菌毒素的精准检测技术开发及应用(计划编号:2015C32018)"进行验收。验收专家组审核了相关资料,听取了课题组汇报,经质询和讨论,形成意见如下: 1.项目提供的验收材料齐全规范,符合验收要求。 2.项目利用分子偶联和荧光标记技术,开展了赭曲霉素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、伏马毒素(FB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等单克隆抗体、核酸适配体、量子点人工抗体和生物素标记物的制备,及基于ELISA、胶体金、适配体和量子点技术的霉菌毒素检测方法研究。 3. 项目建立了OTA、AFB1、FB1和ZEN的ELISA检测方法各一种,检测低限符合国家霉菌毒素残留限量标准;基于适配体技术检测OTA和FB1的方法,灵敏度分别为1 ppb和0.1 ppb;基于量子点的OTA检测技术,灵敏度达0.02 ppb。项目研制了OTA和ZEN胶体金免疫层析试纸条,灵敏度均达到0.25 ppb。 4. 项目申请发明专利1项,检测样品2万余份,培训相关技术人员共400人次,培养研究生2名 5. 项目预算经费15万元,均由财政拨款,已全部到位。经承担单位内部财务决算,实际支出14.31万元,结余经费0.69万元。经费使用基本合理。 验收专家组一致认为,该项目已完成了项目任务书规定的合同内容和技术指标,验收合格。
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    发布机构:浙江省科技厅 发布时间:2017-05-31

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